Florey a dél-ausztráliai Adelaide-ben született egy iskolaigazgató fiaként. Az adelaide-i St Peter's College-ba és az Adelaide-i Egyetemre járt, ahol 1921-ben Bachelor of Science fokozatot, 1924-ben pedig orvosdoktor fokozatot szerzett.
Az orvosi diploma megszerzése után Florey a Walter és Eliza Hall Orvosi Kutatóintézetben dolgozott Melbourne-ben, ahol megismerkedett Ernst Chainnel. 1928-ban az Oxfordi Egyetem Sir William Dunn Patológiai Iskolába költöztek, ahol elkezdtek dolgozni a penicillin kifejlesztésén.
A penicillint 1928-ban fedezte fel Alexander Fleming, de nem fejlesztették használható gyógyszerré. Floreynek és Chainnek sikerült elkülönítenie a penicillin hatóanyagát és megtisztítania, hogy beadható legyen a betegeknek. Módszereket dolgoztak ki a penicillin tömeggyártására is, ami lehetővé tette annak széles körű alkalmazását a második világháború idején.
Florey és Chain penicillinnel kapcsolatos munkája számtalan életet mentett meg a második világháború alatt, és forradalmasította a fertőző betegségek kezelését. Florey 1945-ben fiziológiai és orvosi Nobel-díjat kapott, 1944-ben pedig lovaggá ütötték.
Florey jeles adminisztrátor és oktató is volt. 1959 és 1962 között az Oxfordi Egyetem rektorhelyettese, 1960 és 1965 között a Londoni Királyi Társaság elnöke volt. Az Ausztrál Tudományos Akadémia, az Amerikai Művészeti és Tudományos Akadémia munkatársa is volt. és a Nemzeti Tudományos Akadémia.
Florey agyvérzésben halt meg 1968-ban Oxfordban. A 20. század egyik legfontosabb ausztrál tudósaként tartják számon, és a penicillinnel kapcsolatos munkája milliók életét mentette meg.